泛素化（ubiquitination）是真核细胞中最重要、最复杂的翻译后修饰之一。泛素（ubiquitin）是一种由76个氨基酸组成的高度保守小蛋白，其C末端可通过异肽键或肽键与另一泛素分子的7个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）或N端连接，形成具有不同链长、连接方式和拓扑结构的泛素链。这些结构多样的泛素链携带着不同的生物学信息，被认为是细胞内重要的“信号编码语言”，广泛参与蛋白质降解、DNA损伤修复、先天免疫、自噬等关键生命过程。不同泛素链如何通过其独特的结构与动态特征实现精准的信号传递，其构效关系至今仍未被完全阐明。
然而，由于天然酶促泛素化体系存在底物选择性、链型控制以及产物异质性等限制，如何高效制备具有明确连接类型、长度和标记位点的均一泛素链，仍是泛素化学和结构生物学领域的重要挑战。近年来，化学合成和半合成方法为构建均一泛素链提供了新的思路。研究人员发展了多种基于化学连接、酶辅助组装以及遗传密码子扩展的方法，但现有策略往往受到反应条件苛刻、步骤繁琐、链延伸方向受限等问题限制。因此，发展一种温和、高效且具有模块化能力的泛素链组装方法，对于深入研究泛素链结构和功能具有重要意义。与此同时，泛素链在溶液中通常处于多种构象共存的动态平衡状态，传统晶体学等静态结构解析方法难以全面捕捉其真实的构象分布和动态行为，从而限制了对泛素信号传递分子机制的深入理解。
近日，南开大学苏循成教授课题组在Journal of the American Chemical Society上发表研究论文，发展了一种酶控保护基辅助的级联生物偶联策略，实现了泛素链的可控、定向和模块化组装，为利用核磁共振（NMR）和电子顺磁共振（EPR）等生物物理技术高分辨率解析复杂泛素链的结构、动态行为及分子识别机制提供了新的技术平台，并初步阐述了细胞内外泛素链构象的动态行为。
在前期研究中，研究团队设计并发展了一系列基于吡啶骨架的硫醇修饰试剂。通过调控吡啶骨架上的电子效应，发展了一系列高活性的4-苯砜基吡啶类硫醇偶联试剂，为后续实现具有动力学调控特征的连续硫醇偶联策略提供了重要化学基础（Chem. Commun., 2015, 51, 2824–2827; Acc. Chem. Res., 2019, 52, 1675–1686; Chem. Commun., 2016, 52, 11535–11538）。在本工作中，研究团队首先系统优化并深入研究了课题组前期开发的双功能硫醇偶联试剂与泛素半胱氨酸突变体之间的反应特性，从中筛选出一种反应效率更高、选择性更优的硫醇偶联试剂5-fluoro-4-(phenylsulfonyl)pyridine-2-carbonitrile (FPPN)。结合近期建立的转硫酶催化蛋白质C端半胱氨酸可逆保护/脱保护策略，成功实现了多种同型链、混合链及支链泛素链的逐步、精准和高效组装（图1）。
该平台兼具组装效率高、反应条件温和和功能化兼容性好的特点，不仅能够通过重组表达便捷获得泛素组装单元，而且能够方便地引入稳定同位素、自旋标签及其他功能探针。相比现有泛素链构建方法，该策略具有操作简便、成本较低、易于规模化制备等优势；每一步偶联反应均可获得约80%的分离产率，最终实现K63连接型Ub6链超过25%的总体产率；尤其适用于构建满足NMR、EPR等结构生物学研究需求的功能化泛素链样品，为解析复杂泛素信号网络的结构基础、动态行为及其分子识别机制提供了稳定可靠的样品制备平台。
图1. 泛素C端半胱氨酸保护与去保护策略以及结合FPPN偶联试剂定向、可控地级联的硫醇偶联反应构建多聚泛素链的策略。图片来源：J. Am. Chem. Soc.
利用该平台，研究团队首先构建了一系列同位素标记的K48和K63连接泛素链，并利用15N-HSQC、化学位移扰动（CSP）分析以及弛豫实验系统研究其结构特征（图2）。研究发现，FPPN连接的泛素链保持了与天然泛素链相似的整体构象特征和关键识别界面。其中，K48连接泛素链维持紧凑构象，而K63连接泛素链则保持开放构象，与天然泛素链的结构特征高度一致。进一步的蛋白相互作用研究表明，化学构建的泛素链与泛素受体蛋白Rpn1具有与天然泛素链相似的结合模式和结合亲和力，FPPN连接的泛素链能够保留典型的泛素识别界面，并表现出与天然异肽键连接泛素链相近的结合亲和力。
FPPN连接不仅保留了泛素链的主要结构特征，还赋予其优异的化学和生物稳定性。研究表明，该连接在高浓度GSH和细胞裂解液中均保持稳定，适用于复杂生物环境中的结构与功能研究。需要指出的是，FPPN形成的人工连接结构可能在连接区域附近引入局部结构扰动，从而影响依赖连接位点精细识别的特异性抗体结合，并潜在影响部分去泛素化酶（DUBs）的识别与切割。
进一步地，研究团队发展了与该组装平台兼容的自旋标记策略，成功构建了自由基标记的支链泛素链，并结合双电子-电子共振（DEER）技术实现了泛素链长程构象信息的测定。基于该平台，研究团队进一步利用DEER技术研究了K11/K48和K48/K63两种支链泛素链的构象行为。结果发现，支链泛素链在体外缓冲液中呈现多种构象共存的动态平衡状态；而在细胞裂解液环境中，K11/K48支链泛素链的构象分布明显向更加紧凑的状态偏移（图2）。进一步地利用DEER技术探究了K11/K48支链泛素链与Rpn1在不同生物环境中的相互作用，稳定泛素链的特定构象状态（图2）。这些结果表明，泛素链的构象状态受到细胞环境、分子拥挤效应以及结合蛋白等多重因素的动态调节，为理解细胞环境下泛素信号识别与传递机制提供了新的结构视角。
图2. (A–B) 15N-HSQC分析FPPN偶联构建的K63和K48多聚泛素链；(C–E) DEER表征自由基标记K11/K48支链泛素链在缓冲液、细胞裂解液和拥挤环境中的构象分布及其与Rpn1相互作用后的构象变化。图片来源：J. Am. Chem. Soc.
综上所述，该研究建立了一种高效且兼容功能化修饰的泛素链构建策略，为泛素链的精准构建及其在细胞环境中的动态构象研究提供了新的技术工具；从实验层面揭示了细胞环境能够重塑支链泛素链的构象分布，为理解泛素信号在真实生理环境中的传递机制提供了新的视角。未来，通过设计并引入不同类型的连接子和功能探针，整合多种生物物理技术有望在细胞环境中深入解析泛素信号的动态调控机制。
南开大学化学学院、元素有机化学全国重点实验室、有机新物质创造前沿科学中心苏循成教授为该论文的通讯作者，博士后潘彬彬、研究生周驰、杨茵特聘研究员为该论文的共同第一作者。
论文信息：
Efficient and Controllable Assembly of Multitype Polyubiquitin Chains via Enzyme-Assisted Thiol Ligation for Structural Elucidation
Bin-Bin Pan, Chi Zhou, Yin Yang, Xing Zhang, Chao-Yu Cui, Yang Li, Xun-Cheng Su*
J. Am. Chem. Soc., 2026, DOI: 10.1021/jacs.6c04268
