抗体偶联药物（Antibody–Drug Conjugates，ADCs）的精准构建对连接化学的效率与稳定性提出了更高要求。2026年9月25日，南开大学苏循成教授团队在Angewandte Chemie International Edition上发表了题为Proximity-Induced Disulfide Rebridging Enables Modular Construction of Stable Antibody-Drug Conjugates的研究论文。
研究团队开发了一种邻近诱导二硫键重桥接策略，通过异三官能化吡啶试剂在温和条件下实现抗体二硫键的高效、稳定重桥接，并利用醛基可进一步偶联引入荧光探针和药物分子，构建出具有良好稳定性和高细胞毒性的ADC，为抗体偶联药物的化学构建提供了新的策略。
该方法的一个重要优点是在充分保证抗体三维结构完整基础上的高效化学偶联反应，并赋予偶联产物良好的稳定性，为ADCs及其他类型偶联物（XDCs）的模块化构建提供了新的化学工具。
ADCs通过将具有靶向能力的抗体与细胞毒性小分子药物连接，使药物能够选择性递送至特定肿瘤细胞。近年来，随着ADC药物不断进入临床应用，如何在不改变天然抗体结构的前提下，实现药物的位点选择性、高效且稳定的偶联，成为抗体药物化学领域的重要研究方向。
天然抗体中含有多个二硫键，其中部分二硫键能够被选择性还原，形成具有反应活性的半胱氨酸，为抗体位点选择性修饰提供了天然位点。因此，二硫键重桥接（disulfide rebridging）成为一种重要的抗体偶联策略。该方法首先还原抗体链间二硫键，再利用双官能团试剂重新连接两个半胱氨酸，从而在避免抗体工程改造的情况下实现抗体功能化。
天然IgG1抗体的铰链区具有高度柔性和一定的构象无序性，二硫键还原后暴露的半胱氨酸可能呈现不同的空间取向，从而增加二硫键重桥接及抗体均一偶联的难度。传统的二硫键重桥接试剂通常采用两个相同的亲硫反应基团，其反应活性与所形成连接键的稳定性之间往往难以兼顾：反应性较高的试剂能够提高链间二硫键的重桥接效率，但形成的连接键可能进一步发生硫醇交换，影响偶联产物的稳定性；而反应性过低的试剂则可能导致重桥接反应效率下降。因此，基于抗体结构特征，兼顾二硫键重桥接反应的效率与所形成连接键的稳定性，仍是ADC偶联化学选择面临的关键挑战。
本文的核心设计理念是：发展一种体积小、水溶性好、能够在近生理条件下有效重桥抗体中溶剂暴露二硫键的重桥接试剂，利用两个硫醇反应基团之间的动力学差异及重桥反应过程中的邻近诱导效应，在提高重桥接效率的同时增强连接产物的稳定性，从而实现抗体的位点特异性和稳定偶联，并进一步用于ADC的构建。
针对上述问题，南开大学苏循成教授团队设计并评价了一类具有差异化反应动力学的异三官能团吡啶类二硫键重桥接试剂，包括5-fluoro-4-(phenylsulfonyl)picolinaldehyde（FPPA）及其衍生物FPPAc。
与传统含有两个相同亲硫反应基团的重桥接试剂不同（图1），FPPA分子同时包含两个反应活性不同的亲硫基团——氟原子（F）和苯基磺酰基（PS），以及一个吡啶醛基。研究团队前期发现（https://doi.org/10.1002/anie.202205597），在吡啶2位引入体积较小且具有不同电子效应的吸电子基团，如醛基或乙酰基，可以使F和PS基团表现出明显不同的硫醇反应动力学，将这类试剂用于分子间半胱氨酸交联。
基于这一特点，本工作进一步设想将其应用于蛋白质分子内二硫键的重桥接。抗体二硫键还原后形成的两个半胱氨酸在蛋白质三维结构中具有天然的空间邻近性，其中一个半胱氨酸的巯基可优先、快速地取代FPPA中反应活性较高的F基团；随后，借助两个半胱氨酸之间的空间邻近效应，另一个半胱氨酸的巯基可进一步促进反应活性较低的PS基团发生邻近诱导的分子内SNAr反应，从而实现二硫键的连续重桥接。与此同时，反应后保留的吡啶醛基可作为进一步修饰的化学把手，用于安装药物、荧光探针等功能分子。
这一设计将反应动力学差异与邻近效应相结合，在同一个分子中实现了“快速初始反应—邻近加速后续反应”的连续过程，为兼顾二硫键重桥接效率和连接键稳定性提供了新的设计思路。
图1 以往报道的二硫键重桥接策略与本文发展的抗体偶联物构建策略。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
从抗体片段到全长抗体，实现高效二硫键重桥接
研究团队首先以trastuzumab（Tmab）Fab片段作为模型体系，考察FPPA和FPPAc的二硫键重桥接能力。实验结果显示（图2），FPPA和FPPAc均能够有效重桥接还原后的Fab二硫键，在优化条件下可获得接近95%的目标重桥接产物。对反应中间体进行LC-MS分析发现，该反应经历了F基团取代和PS基团取代的连续过程，且第二步分子内反应受到明显的邻近效应促进（图2B）。为上述“快速初始反应—邻近诱导后续反应”的设计机制提供了实验依据。进一步的稳定性实验表明，与传统连接方式相比，该策略形成的重桥接产物在5 mM GSH条件下表现出更好的稳定性。
图2 邻近诱导的异三官能亲电试剂介导的二硫键重桥接。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
随后，研究人员将该方法拓展至全长trastuzumab（图3）。作为IgG1抗体，Tmab含有4个溶剂可及的链间二硫键，其中铰链区具有较高的构象柔性，因此也对二硫键重桥接提出了更大的挑战。通过优化TCEP与FPPA的加入方式、试剂比例、pH以及反应时间等条件，研究团队建立了原位、分步加入TCEP和FPPA的反应模式，实现了约90–95%的二硫键重桥接。其中，主要产物来源于不同重链之间的二硫键重桥接；另一部分则通过铰链区同一条重链内部二硫键的重桥接。在优化条件下，超过80%的Tmab-PyA主要物种携带4个FPPA修饰单元，表明该策略能够实现较高程度的多位点均一修饰。
进一步结合抗体结构模型，研究团队对二硫键重桥接过程中不可避免形成半抗体产物的结构原因进行了分析。
进一步研究表明，该策略并不局限于trastuzumab。FPPA还可用于其他抗体片段和抗体以及lysozyme等具有不同结构特征的蛋白质体系，展现出良好的底物适用性和二硫键重桥接能力。
图3 FPPA/FPPAc介导的全长抗体二硫键重桥接。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
保留“化学把手”，实现抗体的模块化后功能化
FPPA策略的另一特点在于，二硫键重桥接完成后，吡啶醛基仍能够保留在抗体表面，为后续功能化提供了正交的化学把手。
研究团队利用吡啶醛基与羟胺或1,2-氨基硫醇之间的特异性反应，实现了Tmab-PyA的进一步功能化。其中，1,2-氨基硫醇能够与吡啶醛基发生环化反应，形成稳定的噻唑烷连接结构。基于这一策略，研究人员成功将肽段和Rhodamine B荧光探针等功能分子安装到重桥接后的抗体上（图4）。所得荧光抗体偶联物在35%人血浆中37°C孵育两周后仍表现出良好的稳定性，同时保留了HER2介导的细胞结合与内化能力。
这一结果说明，FPPA不仅能够用于“重新连接”抗体二硫键，还能够进一步实现不同功能分子的模块化安装，为后续构建不同类型的抗体偶联物提供了灵活的化学平台。
图4 基于醛基化学的FPPA重桥接抗体（Tmab-PyA）后功能化。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
模块化安装payloads，构建多种ADC
在此基础上，研究团队进一步利用Tmab-PyA上的吡啶醛基进行payload安装，构建ADC（图5）。研究团队设计并合成了4种payload，分别引入不同的反应基团、可切割的二肽linker以及MMAE或MMAF毒素，并通过两类不同的偶联方式实现payload的安装：一是利用氨氧基功能化payload与醛基形成肟（oxime）连接；二是利用1,2-氨基硫醇功能化payload与吡啶醛基发生环化反应形成噻唑烷（thiazolidine）连接。
基于上述两种偶联策略，研究团队成功构建了ADC-1至ADC-4。LC-MS分析显示（图5C），所得ADC的主要产物均为携带4个payload的抗体，进一步证明了该策略良好的修饰均一性。同时，借助醛基与1,2-氨基硫醇间高效地环化反应特点，控制不同payload的加入比例，还进一步实现了MMAE和MMAF两种payload的连续一锅法安装，获得了双payload ADC-5，其主要物种同时携带MMAE和MMAF。
这一“先二硫键重桥接、再利用醛基安装payload”的策略，使抗体二硫键重桥与payload偶联两个过程相对独立，为进一步构建不同药物、荧光探针及其他功能分子的抗体偶联物提供了便利。
图5 基于FPPA重桥接抗体的payload偶联及ADC构建。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
稳定性、抗原结合与细胞毒性评价
稳定性研究表明，FPPA重桥接形成的抗体具有良好的化学和结构稳定性。在5 mM GSH条件下孵育6天，重桥接形成的硫醚连接键未观察到明显的硫醇交换反应，表明该连接结构具有较好的还原稳定性。同时，在完整抗体三维结构的空间限制下，重桥接后保留的吡啶醛基仍能够保持良好的反应活性，为后续功能化提供了稳定的化学把手。进一步地，所得荧光抗体偶联物在35%人血浆中37°C孵育两周后仍表现出良好的稳定性；共聚焦成像结果显示，功能化后的抗体仍保留HER2介导的细胞结合与内化能力。
研究团队进一步对所得ADC的理化性质进行了评价（图6）。SEC分析显示，各ADC均保持较高的单体比例，主要产物中超过95%以单体形式存在。SPR实验表明，ADC-1、ADC-2和ADC-4对HER2胞外结构域的结合亲和力与裸Tmab总体相近，说明经过二硫键重桥接和payload安装后，抗体的整体结构和抗原识别能力仍得到较好保留。
在体外细胞实验中，所得ADC在HER2阳性的SK-BR-3和NCI-N87细胞中均表现出显著的细胞毒活性，而对HER2阴性的MCF-7细胞表现为较低的细胞毒性（图7）。在SK-BR-3细胞中，各ADC的IC50约为2–10 pM，相较裸Tmab表现出更强的细胞毒活性。其中，MMAF负载ADC以及同时负载MMAE/MMAF的双payload ADC表现出较强的体外细胞毒作用。
图6 所构建ADC的聚集稳定性及抗原结合亲和力表征。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
图7 FPPA重桥接ADC的体外细胞毒性评价。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
总结与展望
综上，研究人员开发了一种基于邻近诱导连续SNAr反应的二硫键重桥接策略。该策略利用两个亲硫反应基团之间的动力学差异，并结合二硫键还原后半胱氨酸之间的空间邻近效应，实现了天然抗体链间二硫键的高效重桥接。与此同时，反应后保留的吡啶醛基为进一步功能化提供了正交化学把手，使重桥接后的抗体能够继续进行模块化修饰，并实现荧光探针、药物payload等不同功能分子的安装。
以trastuzumab为代表的抗体偶联实验表明，该方法能够在保持抗原结合能力和较好结构稳定性的同时，构建具有不同payload组成的ADC，并在HER2阳性肿瘤细胞中表现出显著的体外细胞毒活性。与传统偶联试剂相比，该偶联策略有望在XDCs的精准构建与性能优化方面展现出独特优势。
然而，该研究目前主要从体外化学稳定性、抗原结合能力及细胞活性等方面验证了这一策略的可行性。其体内药代动力学、抗肿瘤疗效以及与现有ADC偶联技术相比的潜在药理学优势，仍有待在后续研究中进一步评估。
南开大学元素有机化学全国重点实验室苏循成教授、曹婵研究员与与Axcynsis Therapeutics邹斌博士为该论文的共同通讯作者，博士后潘彬彬、博士生周小晖、张兴为该论文的共同第一作者。
Bin-Bin Pan†, Xiao-Hui Zhou†, Xing Zhang†, Mo-Han Li, Jia-Long Zhao, Ping Du, Chan Cao*, Bin Zou*, Xun-Cheng Su*.
Proximity-Induced Disulfide Rebridging Enables Modular Construction of Stable Antibody-Drug Conjugates.
Angew. Chem. Int. Ed. 2026, e3744091. doi.org/10.1002/anie.3744091
