背景介绍
谷胱甘肽（GSH）是细胞内重要的生物硫醇，能够维持细胞内氧化还原稳态并参与多种生理活动。GSH在药物运输以及解毒方面发挥着重要作用，癌细胞中GSH的含量增加通常与化疗药物耐药性的增加有关。
实时定量检测细胞内GSH对监测与代谢或病理过程相关的细胞内生理条件的变化至关重要。常用的检测方法主要是通过GSH的不可逆消耗检测探针在光谱上的变化，这类方法无法实时监测细胞内GSH的含量变化。随着可逆荧光探针的发展可以实现细胞内GSH的实时定量检测。活细胞内GSH的实时稳态及变化情况在原子分辨水平的信息仍难以呈现，探针的泄露与定量检测的准确性仍然待解决。
细胞内核磁共振技术（In-cell NMR）能够提供原子分辨水平的结构信息常被应用于研究细胞内蛋白质结构和动态变化。19F-NMR具有较高的灵敏度，化学位移分布广，无背景信号干扰等优点，因此适合用于活细胞内的生化分析。基于以上几点，我们旨在建立一种动态19F-NMR方法，通过一种可逆的方式监测活细胞中GSH水平，并实时测定细胞对生长环境因素变化过程中GSH的定量变化及应对情况。
文章亮点
发展了一系列高性能的含氟可逆探针，这类探针可以在生理条件与生物硫醇发生可逆反应，并且能达到同时区分。探针与GSH加合物的解离平衡常数为0.41 mM，能够通过19F-NMR从原子分辨水平实现GSH的定量检测。
探针够快速跨膜且与细胞内GSH发生可逆反应从而实现细胞内GSH的定量检测，避免了细胞内GSH的泄露，能够近细胞生长环境下实现活细胞内GSH的实时定量。
该可逆检测方法发现不同细胞系中活细胞与其制备的细胞裂解液中的GSH含量具有明显的差异，其中癌细胞与正常细胞系对裂解液制备方式差异显著。
图文解读
作者在基于自己已有的研究中发现，不可逆检测探针进行细胞内GSH的测定时会存在明显的GSH泄露，从而难以定量检测细胞内GSH。因此，作者设计并合成含有迈克尔受体的氟探针P1-P3，旨在通过迈克尔受体与GSH发生可逆反应从而减少对细胞内GSH的消耗。通过稳定性和活性评价发现，探针P1具有很好的稳定性，GSH反应活性以及合理的解离平衡常数Kd，因此，该探针可进一步应用于细胞内GSH的定量检测。
图1. 探针P1-P3的结构式以及与GSH反应化学方程式。
作者首先选用HeLa细胞进行细胞内实验，将细胞收集至核磁管中并加入探针P1，结果发现细胞内19F-NMR具有与体外类似的P1-SG的产物峰且纯探针P1只有一种信号峰，该结果表明探针P1可快速跨膜并进行细胞内GSH检测。除目的信号峰外，作者观测到有其他两种氟信号峰产生，经确认后将这两种信号峰分别归属为探针双键还原后的产物以及探针少量水解产物醛的还原产物。采集结束后将样品收集离心后采集上清的氟谱中未观测到P1-SG产物峰，与之前报道的19F-NHS探针相比，该方法能够有效避免GSH的泄露。根据以上结果明确显示该探针可用于细胞内GSH的定量检测。
作者进一步选用多种细胞系包括NIH-3T3、HEK293T、HepG2、A549细胞系进行细胞内GSH的定量检测，实验结果显示不同细胞内探针与GSH的解离平衡常数存在明显差异且癌细胞中普遍具有更高浓度的GSH。此外，作者通过裂解液中GSH的定量结果表明该方法具有较高的准确性。在上述实验过程中核磁采集温度为298K，作者进一步探讨了温度变化对细胞内GSH的含量测定的影响，结果表明在293到310 K温度范围内，细胞内GSH的含量基本稳定在一个数值，但是探针与细胞内GSH形成加合物的解离常数（Kd）随着温度的升高显著增大。根据Kd与温度的关系，作者进一步计算了细胞内探针与GSH的反应的焓变与熵变，测定结果显示HEK293T细胞内为-49.8 KJ/mol以及-0.10 KJ/(mol∙K)，而HepG2细胞内为-58.9 KJ/mol以及-0.12 KJ/(mol∙K)，表明在细胞内探针与GSH的反应由焓驱动。
在图2e中作者概况了可逆探针定量测定活细胞内GSH的高分辨方法，其中探针可以自由进出细胞内外，而GSH和探针形成的加合物保留在细胞内，通过反应平衡常数可以利用NMR快速测定细胞内GSH的含量变化。
根据以上研究，作者进一步利用该探针检测NEM以及BSO处理后细胞内GSH的含量的实时变化。向HEK293T细胞中逐渐加入NEM后，我们能明显观测到探针与GSH的产物峰逐渐减少。同样，将HepG2细胞用BSO(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂)处理不同时间后发现细胞内GSH明显减少。因此，以上结果表明该氟探针P1通过19F-NMR能够用于细胞内GSH的实时检测。
图3. NEM或BSO处理后细胞内GSH含量的实时变化。
总结与展望
本工作首次报道了一种可逆氟探针P1，与之前报道的19F-NHS探针相比，P1能够快速跨膜并与细胞内GSH快速反应，有效减少了GSH的消耗并避免了细胞内GSH的泄露，可从原子分辨水平定量检测细胞内的GSH含量并能够用于追踪细胞内GSH的实时变化。该工作为后续研究不同病理或培养基改变条件下细胞内GSH的实时变化提供了一种新的高效定量方法。
通讯作者信息
苏循成，南开大学教授，博士生导师，南开大学元素有机化学国家重点实验室固定研究人员。苏循成教授长期从事蛋白质修饰化学和生物磁共振研究，在蛋白质定点修饰、顺磁探针发展和顺磁效应的质量评价与应用方面做出了一些较重要的工作。发展了一系列较为实用的蛋白质定点标记方法和应用于细胞内磁共振研究的顺磁探针。近年来利用19F NMR发展了一系列定量检测生物有机分子和同时定量手性化合物的氟探针，并在发展阐述细胞内蛋白质结构变化与稳定性的方法学中做了大量工作。已在Acc. Chem. Res., PNAS, Angew. Chem. Int. Ed., ACS Cent. Sci. 等期刊发表论文 80 余篇。
ACS Cent. Sci. 2023, ASAP
Publication Date: July 21, 2023
https://doi.org/10.1021/acscentsci.3c00385
Copyright © 2023 The Authors. Published by American Chemical Society
