选择性生物分子交联技术在现代生物制药领域具有不可替代的重要性。随着该领域的快速发展，对兼具更高精确度、灵活性和实用性的新型交联方法的需求日益迫切。近日，南开大学陈弓教授团队报道了一种新型的双胺可逆选择性交联技术。该方法通过乙醛酸与两种烷基胺之间的氧化脱羧缩合反应，成功构建了甲脒键，实现了多肽的分子内装订和分子间偶联修饰。此方法对一级胺和二级胺展现了独特的异质交联选择性。更为重要的是，通过在甲醇或水溶液中添加乙二胺或肼，可在温和条件下断裂甲脒键，释放出原始的氨基官能团。这种基于甲脒的“易上易下”双氨基连接策略，为天然胺类分子的交联修饰提供了一种简洁且可逆的C1连接子（见图1）。
图1. 基于甲脒的双胺可逆选择性交联策略
醛和胺之间的反应是自然界和化学合成中至关重要的一类反应。2023年，陈弓教授团队通过邻苯二甲醛（OPA）与双胺反应，构建含环状C1-芳基脒基团的异吲哚亚胺，实现了双胺的选择性偶联（图2）。芳基与脒基之间的强共轭效应显著增强了产物在生理条件下的稳定性。受此启发，陈弓团队设想在两个胺之间引入不含C1-芳基的简单甲脒结构，并探讨这种缺乏芳基共轭的甲脒键是否能在温和条件下实现解离。目前，直接通过甲脒连接两个烷基胺的方法尚未报道。Kita在2004年利用NBS作为氧化剂，实现了一种通过1, 2-二胺与乙醛酸反应高效合成咪唑啉的策略（图2），这是在动力学极为有利的条件下实现此类转化的罕见例子。
图2. 脒合成的代表性策略
基于此，作者选取了含有两个Lys的四肽NA-Lys-Gly-Ala-Lys-NH2（1）作为模板底物，使其在MeOH中与1.2 equiv乙醛酸、3 equiv DIPEA反应15 min后，再向体系中加入1.2 equiv NBS，于室温下反应2 h，即可以94%的LC收率得到环肽产物2（图3）。然而，当底物含有易氧化残基（如His、Tyr、Trp、Cys和Met）时，会观察到不同数量的副产物。为减少NBS氧化剂引起的副反应，作者进一步探讨了电化学氧化策略。该方法避免氧化剂的直接加入，从而提供更可控的条件来完成脱羧消除过程，降低副产物生成。
图3. 模板反应与条件
随后，作者对底物进行了进一步拓展。如图4所示，在标准反应条件[A]和[B]下，该反应展示了优异的底物适用范围。值得注意的是，Asp（8）、Glu（12）及C-端羧基（13）在两种条件下均不受影响。而Asn（7）、Gln（15）、C-端酰胺（6）、Ser（6）、Thr（18）和Arg（14）也表现出良好的兼容性。短杆菌肽S也可以接近定量转化的收率得到双环肽产物（20）。在NBS条件下，His（9）和Tyr（10）的侧链通常会被少量溴化(< 20%)。但在电化学条件下，这类副产物显著减少。未保护的Trp肽底物在改进的条件[A]下，可高收率生成目标产物（17），而侧链保护的Cys肽底物则以中低等收率得到产物（16）。对于含有Met的肽底物，其产物中的硫醚部分主要被氧化为亚砜（11），但在TFA中通过Me2S和NH4I可将其还原回硫醚。
图4. 基于甲脒的多肽分子内装订
除了用于肽装订的分子内交联，该反应也可用于分子间双胺交联，且对一级胺与二级胺具有独特的异质选择性。如图5所示，不同环大小的二级胺与模板三肽（23）均可高效生成异质交联产物。各种环胺类药物分子如Fasudil（37）、Paroxetine（38）和Desloratadine（39）同样展现出较高的兼容性。链状二级胺（33）也可较好反应。此外，E3配体（41）与ALK抑制剂（42）的交联可以高效且高选择性地构建PROTAC分子。二级胺类药物Fluoxetine（46）和Exatecan（47）与环状肽RGDfK（45）的交联也可构建多肽偶联药物（PDC）分子。
图5. 基于甲脒的多肽分子间异质选择性交联
接着，作者评估了甲脒连接产物的稳定性与可裂解性。如图6所示，模板产物2在pH 3.0至pH 7.0的PBS中24 h可稳定存在，而在pH 9.0的PBS中24 h后，则会产生12%的水解甲酰胺副产物1f和1f’。此外，作者还发现在甲醇中加入6 equiv的乙二胺，或在pH 7.0的PBS中加入10 equiv的肼，均能促使产物的甲脒键完全断裂，从而将交联产物成功转化为起始的原料肽（1）。同样，双环肽（20）、生物素标记的偶联产物（43-44）及Click反应二次修饰产物（57）中的甲脒键，在水合肼的作用下均可被断裂，并释放出原料肽或胺分子。
图6. 甲脒连接子的稳定性和可逆解离
如图7所示，该可逆交联策略同样适用于核酸和磁珠等复杂体系。例如，药物Paroxetine（38）可与寡核苷酸5'-NH2-C6-AGTCAGTCAGTC-3'（59）的5'端烷基胺高效偶联生成产物（59-38）。在MeOH中，当存在乙二胺时，该偶联产物可实现高效解离。此外，四肽底物（60）和Vortioxetine（49）也可与氨基磁珠实现相同的可逆偶联与解离过程。
图7. 双胺可逆交联策略在寡核苷酸和磁珠中的应用
综上，陈弓教授课题组开发了一种新颖的双胺可逆交联策略。该方法通过乙醛酸与双胺之间的氧化脱羧缩合反应构建出简洁且可逆的C1甲脒连接子，并实现了多肽的分子内环化和分子间偶联。该方法对一级胺和二级胺具有独特的异质交联选择性。虽然使用NBS作为氧化剂提供了更为简便的反应条件，但电化学方法则提供了更高的化学选择性控制。总体而言，本研究为两种烷基胺的分子内和分子间交联提供了一种“易上易下”的甲脒连接策略，为生物分子的修饰提供了新的可逆连接方法。
相关工作最近发表在Angew. Chem. Int. Ed.上，通讯作者为南开大学的陈弓教授，南开大学博士后初鑫为该论文的第一作者，硕士研究生徐小晰和张彰对该工作也做出了重要贡献。
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Formamidine as an Easy-On and Easy-Off Linker for Reversible Crosslinking of Two Alkyl Amines in Peptide Stapling and Conjugation
Xin Chu, Zhang Zhang, Xiaoxi Xu, Wenli Guan, Shuai Jiang, Shaokun Cai, Tianxi Yang, Gang He, Chuanzheng Zhou, Gong Chen
Angew. Chem. Int. Ed., 2025, DOI: 10.1002/anie.202422844
