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陈弓课题组 | 六氟异丙醇溶剂再现神奇:基于-酮醛试剂的订书肽策略

来源:化学加   发布时间:2024/03/12

导读

环肽类化合物为药物研发中化学空间的探索提供了强大的平台。现阶段,通过内源性侧链钉接天然肽的方法尚未得到充分探索,且主要基于半胱氨酸的反应性。为了扩大其适用范围,开发选择性靶向非半胱氨酸的多肽修饰策略尤为重要。近日,南开大学陈弓教授团队报道了通过α-酮醛化合物与双胺交联来对天然肽进行环化(图1)。该策略简单高效适用广泛,能够构建各种咪唑骨架的环肽产物。其中,六氟异丙醇(HFIP)溶剂的使用能加速环化过程,并实现对赖氨酸侧链的高选择性修饰。

图 1. α-酮醛交联双胺构建环肽

α-酮醛类化合物在生命体内由糖代谢产生,能够与蛋白质反应生成晚期糖基化终末产物(图2A和2B)。邻位二羰基结构给α-酮醛带来独特的反应性,使其在生理条件下无需酶催化即可与各种含N基团发生反应。α-酮醛和含N官能团的缩合可能会发生不寻常的重排反应(图1C),生成两分子交联的产物GOLD和MOLD或赖氨素羧基化产物CML和CEL。此外,该过程还能够生成精氨酸修饰产物hydroimidazolone和argpyrimidine,或赖氨素与精氨酸交联产物MODIC(图2B)。

迄今为止,α-酮醛类化合物在生物医药中仅成功应用于对蛋白质中精氨酸残基的标记(图2A)。相比之下,α-酮醛与胺的反应却报道的很少。在Baynes课题组的仿生研究中,他们发现GO可以和简单的烷基胺在生理条件下生成中等收率的GOLD产物(图2D)。然而,该策略同时也会生成大量的N烷基化副产物。随后,Esposito课题组报道了在AcOH和H2O的混合溶剂中额外引入甲醛的方法,可以高效地得到GOLD产物(图2D)。值得注意的是,这两种方法都只在简单的烷基胺底物上进行了验证,对于精氨酸潜在的干扰问题仍未解决。

图 2. GO和MO的相关反应

近年来,南开大学陈弓教授课题组报道了多种基于甲醛的高效且选择性优异的复杂多肽修饰方法(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 6646;J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 10080;J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 5952),其中六氟异丙醇溶剂能显著促进反应的进行。同时受到蛋白质糖基化中MODIC连接体的启发,作者尝试将乙二醛化合物在六氟异丙醇中用于多肽的环化修饰。作者首先尝试了三肽NA-Arg-Gly-Lys-NH2(NA:2-萘甲酰基,用于增强多肽LCMS分析的UV检测)与乙二醛在六氟异丙醇中进行反应,发现该反应并没有生成预想的Arg-Lys交联的MODIC产物,而是主要生成了GOLD产物。随后,作者尝试用含有两个Lys的模板肽NA-Lys-Gly-Ala-Lys-OH 3通过乙二醛进行分子内的关环。作者发现当使用3当量的GO和3当量的DIPEA在10 m浓度的六氟异丙醇中反应30 min即可定量转化成GOLD环肽产物。

随后,作者对多肽底物的适用性进行考察(图3)。作者发现,除半胱氨酸外,该反应对其余天然氨基酸均具有良好的兼容性。含有Tyr(7)、His(8)、Trp(13)、Thr(9)、Ser(9)、Asp(10)、Asn(20)和Met(17)的多肽底物对该反应均耐受。作者发现巯基底物NA-Cys-OH 25能够和GO生成硫代半缩醛产物26及其他一些复杂产物。精氨酸底物NA-Arg-OH 27,能够在标准条件下与乙二醛反应生成小于3%的28a28b的混合物。由此可见,Arg在六氟异丙醇中的反应活性明显低于Lys,特别是与两个Lys的交联反应相比。对于含有精氨酸的多肽底物1014,均能高选择性的得到GOLD产物。同时作者也发现,如果加入大过量的GO或者延长反应时间,也会监测到精氨酸修饰的产物11。两个赖氨酸的距离对于环化效率没有显著影响。此外,该反应对于多种具有生物活性多肽也具有良好的反应效果,如环肽抗生素gramicidin S和N-Ac GLP-1均可以高效转化成相应的环化产物。除了对两分子赖氨酸交联,该策略同样适用于N端与赖氨酸的环化,如2324

图 3. 多肽部分底物拓展

该反应对烷基和芳基取代的α-酮醛衍生物也具有良好的反应效果,能够生成各种官能化咪唑交联的环肽产物(图4)。值得注意的是,取代的乙二醛参与反应会导致生成的咪唑结构含有一对异构体。其中,各种取代的α-酮醛可以通过SeO2氧化的Riley反应轻松制备。α-酮醛上烷基取代基可能会降低多肽环化的效率,因此需要4当量的乙二醛底物在40 oC下反应4小时才能较好的转化。各种链状烷基及环状烷基取代的乙二醛底物均能与模板肽3反应得到相应的环化产物(4a-4e)。对于芳基取代的α-酮醛底物需要升温至60 oC反应12小时才能实现定量转化。如底物4f-4p所示,该反应对苯环上的各种取代基均具有良好的耐受性。此外,该反应还可以在咪唑结构上引入炔基(4r),呋喃基(4q),萘基(4s),芘基(4v)和四苯乙烯荧光基团(4t),进一步丰富环肽骨架的多样性。值得注意的是,芳基乙二醛可能会发生自身反应,生成不同数量的未识别副产物。然而,这些副产物不会影响环化的进程,并且可以通过乙醚后处理轻松的除去。

图 4. α-酮醛部分的底物拓展

如图5A所示,咪唑骨架的交联反应还可以在固相上高效进行。作者首先用Rink树脂通过固相合成方法制备了线性序列。其中,参与交联的赖氨酸的残基用Dde基团正交保护。随后,Dde保护基可以在5%的水合肼的DMF溶液中选择性脱除,并将脱去Dde的树脂在六氟异丙醇中与不同α-酮醛化合物进行环化反应。最后,用TFA/H2O的混合液将多肽从树脂上裂解下来,并通过制备级HPLC纯化,得到相应的环肽产物。

Anoplin是一种具有多种药理活性的短型两亲性α-螺旋毒液肽。最近,有课题组报道Anoplin可以通过金属催化的烯烃复分解反应进行装订,来产生对癌细胞具有溶瘤活性的环肽。作者通过两轮概念验证研究,将α-酮醛介导的固相装订反应用于构效关系探索以提高生物活性(图5B)。在第一轮构效关系研究中,作者通过变换两个赖氨酸的位置和GO进行反应,得到相应的GOLD产物。随后,作者通过对小鼠乳腺癌细胞4T1进行细胞毒性实验,筛选出环肽Ano-DAno-E具有较好的癌细胞杀伤效果。在第二轮实验中,作者基于Ano-DAno-E的序列,与修饰的α-酮醛进行反应,得到各种取代的咪唑环肽产物。作者通过细胞毒性实验,筛选出效果更好的环肽产物,分别是正辛基取代的Ano-Dc(IC50 = 6.6 μM)和对三氟甲基苯基取代的Ano-Eh(IC50 = 6.8 μM)

图 5. 构效关系研究

作者基于前期HFIP促进多肽修饰的探索,提出了针对HFIP促进的条件下的新型MOLD反应机制(图6)。MO首先与烷基胺缩合成可逆的双亚胺中间体I。另一分子MO与双亚胺I反应生成中间体II,随后与体系中的H2O反应得到水合物III。中间体III能够在HFIP的作用下,发生C-C键的断裂,脱去CH3COOH得到中间体IV。最后,中间体IV发生分子内进攻后脱水,得到最终的咪唑骨架产物。其中,中间体III的脱酰化是该反应的关键。作者也在最近的研究中(J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 5952)发现HFIP能够形成聚集体,通过H键介导的大环过渡态进行分子间的氢化物转移。在该反应中,作者认为HFIP聚集体可能在氢键介导的大环过渡态中起到类似质子梭的作用,加速脱酰化的进程(结构V所示)。

综上所述,陈弓课题组开发了利用不同取代的α-酮醛试剂,将天然多肽上两个氨基通过咪唑结构交联。该方法可以在温和的条件下高效高选择性的构建多种咪唑骨架环肽。其中,HFIP的使用是实现高反应性的关键,使得该反应对赖氨酸比精氨酸具有更高的化学选择性。作者还将这些模块化的装订反应用于概念验证实验,通过方便的两轮筛选策略来简化毒液肽Anoplin的溶瘤活性的构效关系研究。  相关工作最近发表于  Angew. Chem. Int. Ed  .    通讯作者为南开大学  陈弓  教授。  南开大学博士研究生  郭盼  为该论文的第一作者。


文献详情:

Pan Guo, Xin Chu, Chengjin Wu, Dr. Tianjiao Qiao, Wenli Guan, Prof. Chuanzheng Zhou, Dr. Tao Wang, Prof. Dr. Changlin Tian, Prof. Gang He, Prof. Dr. Gong Chen*. Peptide Stapling by Crosslinking Two Amines with α-Ketoaldehydes through Diverse Modified Glyoxal-Lysine Dimer Linkers. 

Angew. Chem. Int. Ed. 2024https://doi.org/10.1002/anie.202318893